Forord

Kompendium i mikrobiologi foreligger nå i 3. utgave til bruk ved undervisningen i mikrobiologi ved

HSH avd. forebyggende helsearbeid, Stord. Det er en bearbeiding av mine forelesningsmanuskript slik de har utviklet seg etter 20 års undervisning ved høgskolen.

De viktigste forandringene er et nytt kapittel om prioner. I de andre kapitlene er en del avsnitt er tatt ut og nye tema kommet til. I tillegg har jeg forsøkt å gjøre språket bedre. Til det har jeg fått god hjelp av min sønns norsklærer fra Stord Ungdomsskule, Randi Vengen.

Jeg har også laget en egen hjemmeside: http:// www.dvstord.com. Under avsnitt kompendium er det linker til supplerende stoff og ikke minst gode illustrasjoner til flere av kapitlene. Det vil og være mulighet til å gi tilbakemelding på kompendiet, noe jeg vil sette pris på.

Etter oppdagelsen av penicillinet var en meget optimistiske når det gjaldt kampen mot smittsomme

sykdommer. En periode på 60 tallet var det mange som regnet med at kampen mot disse sykdommene snart var over.

Utviklingen har vist at denne optimismen var grunnløs. Mikroorganismene har slått tilbake på en slik

måte at WHO i sin årsmelding for 1996 skriver: «Verden står på stupet av en global krise i forhold til smittsomme sykdommer».

Intensjonen med dette kompendiet er å forklare denne utviklingen og presentere mikroorganismene og de sykdommer de forårsaker.

Jeg er dyrlege, ikke lege. Bortsett fra de mikroorganismer jeg selv og mine nærmeste har hatt et ufrivillig møte med, har jeg ingen erfaring fra temaet i egen praksis.

Jeg mener likevel at min bakgrunn gir meg forutsetning for å formulere aktuelle problemstillinger innen dette temaet, søke i litteratur etter svar og forhåpentligvis også formidle dem gjennom en forelesningsrekke og i dette kompendiet.

Stord høst 2001

Arne Oftedal

Kviteluren 23

5414 Stord

Tlf: 53 41 14 74 Fax: 53 41 01 80

e-mail: oftedal@online.no http://www.dvstord.com

ISBN 82-994584-0-4

Innholdsfortegnelse

KAPITTEL 1 Side

INTRODUKSJON
Historikk	7
Infeksjonssykdommer i dag	7
Ulike grupper mikroorganismer	8
Bakterier	8
Oppbygging av bakterier	8
En del definisjoner	10
Testing av bakterieresistens	10
Diagnostikk av bakterier	10
Serotyper eller stammer	11
Genteknologi	11
Verktøy i genteknologien	11
Plasmidprofil	12
DNA-segmentering	12
PCR (Polymerase Chain Reaction)	12
Gen som bærer anlegg for arvelige sykdommer	13
Kryssing av artsgrenser	13
Bakterier som fabrikker	13

KAPITTEL 2
GRAM POSITIVE KOKKER
Gram positive kokker	15
Stafylokokker	15
Hva gjør toksinene med kroppen vår	15
Hvordan dannes abscesser	16
Diagnostikk av patogene S.aureus	16
Sykdommer forårsaket av S.aureus	16
Toksisk sjokk syndrom (tampongsyken)	17
Stafylokokkinfeksjoner hos nyfødte	17
Matforgiftning forårsaket av stafylokokker	18
SSSS	18
Koagulase negative stafylokokker	18
Streptokokker	18
Andre sykdommer forårsaket av streptokokker	19
Kjøttetende bakterier	19
Fekale streptokokker	19
Streptokokkus pneumonia	20

KAPITTEL 3
GRAM NEGATIVE KOKKER
Gram negative kokker	21
Neisseria gonorrea	21
Gonore hos kvinne	21
Gonore hos mann	22
Gonore hos nyfødte	22
Terapi og profylakse	22
Neisseria meningitidis	22
Patogenese ved utvikling av meningitt	22
Symptomer ved smittsom hjernehinnebetennelse	23
Behandling og profylakse	23
Vaksinering	23

KAPITTEL 4
GRAM POSITIVE STAVER
Gram positive aerobe sporedannende staver	24
Bacillus cereus	24
Miltbrann (Bacillus Anthracis)	24
Gram positive anaerobe sporedannende staver	25
Clostridium botulinum	25
Clostridium perfringens	25
Clostridium tetani	25
Clostridium difficile	27
Gass-gangren	27
Gram positive syrefaste staver	27
Tuberkulose	28
Mycobacterium leprae	28
Gram positive,ikke sporedannende staver	29
Corynebacterium difteriae	29
Listeria monocytogenes	29

KAPITTEL 5
GRAM NEGATIVE STAVER
Gram negative staver	30
Koliforme bakterier	30
Patogene E.coli	30
Enterohemmorhagisk E.Coli (H:7 O:157)	31
Salmonella	31
Shigella	32
Vibrio cholerae	32
Oral rehydreringsterapi	33
Yersinia enterocolitica	33
Campylobacter	33
Heliobakter pylori	34
Legionella pneumophila	34
Hemophilus influenza	34
Bordetella pertussis	35
Pseudomonas aeruginosa	35
Capnocytophaga canimorsus ”hundebittbakterie”	36
Fransciscella tularensis	36
Proteus	36
Brucella	36
Klebsiella	36

KAPITTEL6
SPIROCHETER,RICKETTSIER,
MYCOPLASMA OG CHLAMYDIA
Spirocheter	37
Treponema pallidum	37
Borrelia burgdorferi	38
Mykoplasmer	38
Rickettsier	38
Chlamydia	38
Chlamydia trachomatis	39
Chlamydia psittaci	39
Chlamydia pneumonia	40

KAPITTEL 7
VIROLOGI
Oppbygging av virus	41
Formering av virus	41
Polio	41
Rhinovirus	42
Coronavirus	42
Influensavirus	43
Adenovirus	43
Rotavirus	44
Paramyxovirus	44
Kusma	44
Meslinger	44
Røde hunder	45
Rabies	45
Herpesvirus	46
Herpes simplex	47
Epstein-Barr virus	47
Varicella-Zooster (vannkopper-helvetesild)	48
Cytomegalovirus	49
Herpesvirus og kreft	49
Kopper	49
AIDS	49
Hepatitt	51
Hepatitt A	51
Hepatitt B	52
Hepatitt C	53
Parvovirus	53
Den 4. barnesykdom	53
Nefropathia epidemica	53
Papillomavirus	53
Behandling av virusinfeksjoner	54
Virus og genterapi	54
KAPITTEL 8
MYKOLOGI
«Barske børnerim»	55
Fordelaktig betydning av sopp	55
Inndeling av sopp	55
Sopptoksiner	56
Soppsykdommer	56
Dermatomykoser	56
Ringorm	56
Diagnostikk av dermatomykoser	57
Infeksjon med Candida Albicans	57
Systemmykoser	58
Cryptococcus neoformans	58
Histoplasma capsulatum	59
Coccioides immitis	59
KAPITTEL 9
PARASITTOLOGI
Protozoer	60
Toxoplasma gondii	60
Cryptosporidier	61
Spolorm	61
Barneorm	62
Trikiner	62
Bendelorm	62
En kuriositet	63
Hodelus	63
Støvmidd	63
Eksotiske parasitter	64
Malaria	64
Schistosoma	64
Trypanosoma	64
KAPITTEL 10 PRIONER
Scrapie	65
Kugalskap	66
Ny sykdom hos mennesker	66
Sykdommen	66
Hva vil skje	66
KAPITTEL 11
IMMUNOLOGI
Immunologi	68
Oppbygging av immunforsvaret	68
Det humorale immunsvar	68
Ulike typer immunglobuliner	69
Primær og sekundær respons	69
Det cellulære immunforsvar	69
Hvordan virker immunsystemet	70
Vaksinering	70
Immunologisk diagnostikk	71
Agglutinasjon	71
Agglutinasjon-inhibisjon	71
Presipitasjon	71
Komplement	71
Diagnostikk av akutt sykdom	72
Når immunforsvaret blir et problem	72
Allergi	72
Astma	73
Hva kan utløse en allergisk reaksjon	73
Immunologisk betingede sykdommer	74
Antibiotika/Kjemoterapeutika	74
En del definisjoner	74
Penicillin	75
Streptomycin	75
Cephalosporiner	75
Sulfa	75
Trimetoprim	76
Tetracykliner	76
Kloramfenikol	76
Litteratur	77
Internettadresser	77

istorikk

I mer enn 10000 år har menneskene blitt plaget med infeksjonssykdommer. Selv om de gamle grekere laget en del definisjoner for å karakterisere disse sykdommene, og de første forsøk på vaksinasjon ble gjennomført på 1600 tallet, var det først på slutten av 1800 tallet menneskene begynte å få forståelsen av hva som forårsaket disse lidelsene. Men til tross for en begynnende forståelse for mikrobiologien, kan vi likevel oppleve at det ikke er mer enn ca 100 siden (1888) at sengetøy fra dysenteripasienter blir vasket i drikkevannskilden i Oslo. Resultatet av dette ble en epidemi med ca 30000 registrerte tilfeller.

Det var på denne tiden det ble gjort store framskritt i forståelsen av de smittsomme sykdommer. Armauer Hansen påviste at lepra skyldes en bakterie, Robert Koch påviste tuberkulosebakterien, Neisser oppdaget gonorébakterien osv.

Neste store framskritt i kampen mot infeksjonssykdommene var oppdagelsen av penicillinet av Fleming i 1920 årene. Dette startet som en tilfeldighet da Fleming hadde en bakterieskål som var blitt forurenset med muggsopp. Etter en tid forsvant bakteriene i nærheten av soppen, og Fleming antok at det måtte være et stoff i soppen som drepte bakteriene. Dette stoffet viste seg å være penicillin.

Den første pasient som ble behandlet med penicillin, var en engelskmann som hadde fått et skrubbsår infisert med gule stafylokokker etter å ha stukket seg på en tornebusk i 1941. Det var en dramatisk effekt av behandlingen, men fordi verdens

lager av penicillin på denne tiden ikke var større enn 4,5 gram, var det ikke tilstrekkelig til å fullføre kuren. Derfor døde pasienten kort tid etter.

Først på slutten av 1940 tallet ble det mulig med industriell framstilling av penicillin. Det ble oppfattet som en mirakelmedisin som markerte begynnelsen på en ny epoke i kampen mot smittsomme sykdommer.

I 1953 klarte Watson og Crick å kartlegge oppbyggingen av arvestoffet (DNA). De påviste at DNA tråden besto av 4 ulike stoff (forkortet A,T,C,G), som lå etter hverandre i to rekker som en dobbeltspiral. Etter dette har andre forskere klart å tyde den genetiske informasjonen som ligger i DNA tråden og utvikle verktøy og metoder for å bruke bakteriene og arvestoffet. Dette kalles bioteknologi og har gitt enorme muligheter (og i høyeste grad farer) når det gjelder for eksempel produksjon av legemidler og andre aktuelle produkter, diagnostikk av sykdommer og identifikasjon av bakterier. Når det gjelder påvisning av

arvelige sykdommer i genene nytter vi også denne metoden. Metodene og prinsippene vil bli nærmere omtalt senere i dette kapittelet.

INFEKSJONSSYKDOMMER I DAG

Til tross for den økte kunnskap om og innsikt i mikroorganismene og deres sykdommer er de fremdeles et aktuelt problem i dag. Vi opplever at «gamle»

mikroorganismer får ny betydning, og at det påvises nye og til nå ukjente infeksjonssykdommer.

Det er flere årsaker til dette.

Økologiske forandringer og utvikling av landbruk bringer menneskene i kontakt med nye og ukjente smittestoff. Dette kan føre til nye sykdommer som f.eks. Lyme’s disease som vil bli omtalt i et senere kapittel (kap 6).

Utvikling innen teknologi og industri kan også øke risikoen for spredning av infeksjonssykdommer. Matvarer produseres i store enheter i bedrifter og kantiner, og smittestoff kan spres gjennom slike produkter. Dette er årsaken til den epidemien av Salmonellabakterier som nå herjer i den vestlige del av verden.

Samferdsel er også en risikofaktor. Kolera ble introdusert til Sør-Amerika fra et asiatisk skip som tømte ballasttankene for vann utenfor kysten av Peru. Bakteriene ble tatt opp av skalldyr og nådde på denne måten menneskene.

Mikroorganismene har en enorm evne til å tilpasse seg. De har utviklet en rekke metoder for å stå i mot antibiotika, slik at resistens er et stort problem innenfor infeksjonsmedisinen.

Bakterieresistens spres lett fra bakterie til bakterie, og det er frykt for at vi snart kan stå overfor bakterier som vi ikke har virksomme medisiner mot.

Sammenbrudd og nedbygging av offentlig helsevesen og sosiale ordninger i flere u- og i- land har også ført til oppblomstring av infeksjonssykdommer. Difteri er et aktuelt problem i Russland og for norske miljøer med kontakter dit. Tuberkulose øker i flere land, bl.a. som følge av AIDS og et økende antall hjemløse i flere storbyer. Dette skjer bl.a. fordi det offentlige helsevesene ikke klarer å følge opp på en god nok måte.

Sykehusinfeksjoner er et annet viktig problem. Bakteriene som klarer å overleve på et sykehusmiljø, er ofte virulente (har stor evne til å forårsake sykdom). En undersøkelse som er gjort i Norge, viste at på en bestemt dag hadde 6,4% av alle

pasienter ved kirurgiske avdelinger ved våre sykehus infeksjoner de hadde blitt påført etter at de kom på sykehuset.

I Norge mener SIFF (statens institutt for folkehelse) at oppslutningen om vaksinasjoner i enkelte områder av landet er så lav at det er fare for at epidemier igjen kan bryte ut. F.eks. er 10% av norske barn uten beskyttelse mot difteri, og det er mange som ikke følger opp vaksinasjonsprogrammet fra helsemyndighetene. Om denne utviklingen får fortsette, vil vi igjen kunne støte på mikroorganismer som vi i dag ikke regner som noe problem i Norge.

Problemet med pasienter som har svekket immunforsvar (AIDS, narkomani, alkoholisme og transplantasjonskirurgi) aktualiserer betydningen av innsikt i mikroorganismene. I disse pasientgruppene er det allerede registrert at til nå ufarlige mikroorganismer blir sykdomsfremkallende. Sykdomsbildet til kjente sykdomsfremkallende mikroorganismer blir et annet og mer alvorlig hos disse pasientene.

ULIKE GRUPPER MIKROORGANISMER

På bakgrunn av de kunnskaper vi har i dag deles mikroorganismene inn i bakterier ,rickettsier , chlamydier, mycoplasmer , virus og sopp. Prioner er en ny aktuell gruppe mikroorganismer. (Dette smittestoffet er årsak til dyresykdommene scrapie og kugalskap, og forårsaker også sykdommen Creuzfeld-Jacobs Disease hos mennesker. Disse tre sykdommene har mye felles, og det er frykt for smitteoverføring fra syke kyr til mennesker.)

I tillegg vil dette kompendiet også omtale en del parasitter som er av betydning i denne sammenhengen.

BAKTERIER

I zoologien grupperes de ulike organismene i:

• orden (Bakterier)

• familie (eks. Enterobakterier)

• genus (eks. Salmonella)

• art (eks. Salmonella typhimurium)

I tillegg kan artene deles inn i ulike serotyper basert på ørsmå ulikheter mellom bakterier av samme art.

OPPBYGGING AV BAKTERIER

Bakteriene har ikke cellekjerne, og derfor ligger DNA- tråden fritt i cellens cytoplasma (cellevæske). Denne cellevæsken består av vann, proteiner, lipider, karbohydrater og salter i en konsentrasjon tilsvarende fysiologisk saltvann (0,9% NaCl).

DNA-tråden består som tidligere nevnt av to rekker kveilet sammen som en dobbeltspiral. Den består av fire ulike baser (Adenin, Thymin, Cytosin og Guanin, fra nå av kun omtalt som ATCG)

Strukturen i DNA- tråden er slik at en A i en kjede står ovenfor T i den andre kjeden, og tilsvarende for C og G.

En slik A-T eller C-G kalles et basepar. Tre slike basepar inneholder nok genetisk informasjon til å lage en aminosyre.

Menneskets arvemateriale bestå av ca. 3 milliarder slike basepar, mens en tarmbakterie (E. Coli) har ca. 5 millioner slike basepar i sin DNA tråd.

Det finnes 20 ulike aminosyrer, og flere aminosyrer i rekke danner et protein. Den delen av en DNA tråd (kromosom) som inneholder nok genetisk informasjon til å lage et protein, kalles et gen.

(Eks: Insulin er et kort protein som består av ca. 250 aminosyremolekyler. Genet for insulin vil da bestå av 750 basepar)

Ved celledelingen vikler de to delene av spiralen seg ut av hverandre, og det dannes en ny DNA- tråd i hver av de to nye cellene. Råmaterialet til den nye delen av spiralen kommer fra cellens RNA gjennom en rekke trinn og reaksjoner.

Ved denne todelingen skal individets egenskaper overføres til neste slektledd, og det er derfor viktig at det ikke oppstår feil under denne prosessen. En slik feil i todelingen kalles en mutasjon. Dette kan skje tilfeldig, men påkjenninger på organismen (forurensing, radioaktiv stråling osv) kan øke risikoen for at det finner sted mutasjoner.

De fleste mutasjoner vil ikke merkes, mens f. eks sigdcelleanemi (en arvelig sykdom som hemmer erytrocyttenes evne til å transportere oksygen) skyldes en enkel base som er erstattet med en annen. Det finner sted forholdsvis få mutasjoner, og forskerne mener at det finnes enzymatiske reguleringsmekanismer i cellen som ser til at todelingen går riktig for seg.

Men det er ikke bare i DNA- tråden bakteriens arvemateriale sitter. I tillegg har bakteriene fritt svømmende i cytoplasma noen ringformede strukturer med arvestoff som kalles plasmider. De viktigste egenskapene som er knyttet til plasmidene, er evne til resistens mot ulike antibiotika/kjemoterapeutika og virulens (grad av sykdom).

Plasmidene deler seg helt uavhengig av DNA- tråden, og kan også spres til andre bakterier ved en prosess som kalles konjugasjon. For å få til dette trenger bakterien hjelp av små hår (pilier) på utsiden av celleveggen. En slik tråd kan vokse ut til en kjønnspilus- en lang tråd som får kontakt med en annen bakterie. Den trekker den nye bakterien til seg, og det oppstår en kanal mellom disse bakteriene. Plasmidene deler seg i den ene bakterien, og den ene kopien vandrer over til den andre bakterien. Dette er den viktigste mekanismen til spredning av antibiotikaresistens. I tillegg finnes en rekke andre som bakteriene har utviklet for å tilpasse seg og overleve.

Piliene fungerer også som bakterienes tilheftingsorgan. Ved hjelp av disse kan bakteriene feste seg til de organer der de forårsaker sykdom (f.eks. epitelceller i tarm eller i halsen). I disse cellene er det strukturer som gjør at piliene passer inn der, og bakteriene setter seg fast og kan forårsake sykdom.

Bakteriecellen er omgitt av en cellemembran som er semipermeabel (halvt gjennomtrengelig) for væske og stoffer. Utenpå denne ligger celleveggen. Denne er av fast struktur og er med på å gi bakteriene en karakteristisk form og farge etter fargemetoder som nyttes på laboratoriet.

De fleste bakteriene er enten runde (kokker) eller avlange (staver). Dersom disse farges etter Gram (en fargemetode som mye nyttes), vil de bli enten blå (Gram positive) eller røde (Gram negative). I tillegg til å være et diagnostisk hjelpemiddel, viser det seg at ulike typer antibiotika/kjemoterapeutika virker best på Gram positive eller Gram negative bakterier. Å avgjøre om en bakterie er Gram positiv eller negativ, har altså betydning i behandlingen av infeksjonssykdommer. Ut fra form og farge kan altså de fleste bakteriene deles inn i fire grupper. Hvilke?

Bakteriene har som andre levende vesener et stoffskifte, og skiller ut avfallsstoffer til sine omgivelser. Disse samles i mesosomer (små blærer) i cytoplasma før de passerer gjennom cellemembran og cellevegg. Utenfor bakteriene kan de legge seg tett inntil celleveggen og danne en kapsel (av stor betydning når det gjelder vaksinering), eller de kan spre seg utover og danne et slags nettverk eller calyx. Dette er aktuelt for en Streptokokkbakterie som fester seg på tennenes emalje. I denne bakteriens nettverk vil matrester og bakterier kunne feste seg og være med på å utvikle caries.

Flere bakterier produserer giftstoff eller toksiner som de skiller ut til omgivelsene. Det er toksinene og virkningen av disse på kroppen vår som er årsak til symptomene ved flere infeksjonssykdommer. Disse vil bli detaljert omtalt under gjennomgang av de enkelte bakterier, men vi slår allerede nå fast at vi skiller mellom

eksotoksiner som skilles ut mens bakteriene er i live,

endotoksiner som sitter i celleveggen og

frigjøres når bakteriene dør og

går i oppløsning og

enterotoksiner som skilles ut under spesielle forhold

i tarmen og som er årsak til en del tilfeller

av matforgiftning.

Virkningen av eksotoksinene er dels å lette etableringen av infeksjoner, dels å stoppe kroppens egne forsvarsmekanismer mot infeksjoner. Endotoksinene har en mer alvorlig virkning på kroppen vår. De kan i verste fall forårsake koma, sjokk og død. Hvordan dette skjer, kommer vi tilbake til senere.

Flagellene er bakterienes bevegelsesapparat. Dette er tråder på utsiden av bakteriene som gjør at bakteriene kan bevege seg. Antall og plassering på celleveggen kan være et hjelpemiddel i diagnostikken.

EN DEL DEFINISJONER

Det er viktig å slå fast at ikke alle bakterier forårsaker sykdom. Vi finner i vårt miljø og på vår hud og slimhinner en rekke bakterier som er ufarlige. (Det er angitt et tall på 100.000 bakterier pr kvadratcentimeter hud).

Flere av bakteriene som utgjør vår normalflora er viktige i kroppens forsvar mot infeksjoner.

Vi skiller derfor mellom patogene bakterier som forårsaker sykdom og a-patogene bakterier som er ufarlige. I tillegg er det en gruppe som vi kaller potensielt patogene bakterier.

Til den siste gruppen hører bakterier som er ufarlige på det sted de har sitt vanlige tilholdssted, men som kan forårsake sykdom dersom de kommer i andre organer. Eksempel på dette er tarmbakterien E. Coli som er a-patogen i tarm, men som kan forårsake cystitt (blærebetennelse) dersom den kommer i urinvegene. I munnhulen kan vi finne en gruppe Streptokokkbakterier som kalles viredansstreptokokker. Dersom disse kommer over i blodet (f.eks. ved tannekstraksjon), kan de slå seg ned på hjerteklaffene og gi hjerteklaffbetennelse.

Denne inndelingen av bakteriene basert på patogenitet blir vanskeliggjort av problemet med immunsuppresivitet (hemming av immunforsvaret). Hos pasienter med denne tilstanden kan som tidligere nevnt a-patogene eller potensielt patogene bakterier bli årsak til alvorlige og livstruende infeksjoner.

TESTING AV BAKTERIERESISTENS

Som allerede nevnt er resistente bakterier et stort problem i medisinen, og det er om å gjøre å finne det mest effektive antibiotikum for å behandle en infeksjon.

På laboratoriet gjøres dette ved å så den aktuelle bakterie ut på overflaten av en bakterieskål. Oppå skålen legges lapper på størrelse med en tiøring impregnert med det aktuelle legemiddel som bakterien skal testes mot. Denne skålen inkuberes (settes i et skap med en bestemt temperatur) i et døgn. I løpet av denne tiden vil legemiddelet sive ut fra lappene, og dersom bakterien ikke er resistent, vil det drepe de bakteriene som vokser i nærheten av lappen. Resistente bakterier vil fremdeles vokse helt inn til lappen. Ut fra størrelsen på den bakteriefri sonen kan vi avgjøre hvilket legemiddel som er mest effektivt for å bekjempe den aktuelle infeksjonen.

DIAGNOSTIKK AV BAKTERIER

For å dyrke fram en bakterie og sette navn på den, må en gjennomføre bestemte analyser på laboratoriet.

1. Dyrking på spesielle medier

Det finnes en rekke næringsmedier eller agar til bruk for dette. Disse er enten generelle (alle bakterier vokser like godt), eller selektive (tilsatt stoffer som fremmer vekst av den bakterien vi mistenker og hemmer vekst av andre).

En bakterie formerer seg ved hjelp av todeling, og under optimale forhold kan generasjonstiden være så lav som 8–10 minutter. En bakterie vil da i løpet av et bestemt tidsintervall bli til en stor bakteriehop eller koloni som er synlig, og som kan ha en bestemt form, farge eller lukt avhengig av hvilken bakterie som vokser. En erfaren mikrobiolog kan allerede på dette stadiet få en mistanke om hvilken bakterie det er som vokser på skåla. Men det bør i alle fall bekreftes med å gå til neste trinn som er

2. Gram farging og mikroskopi.

Her avgjøres om det er en stavbakterie eller kokk, og om den er Gram positiv eller Gram negativ. Likevel er dette sjelden nok til å sette navn på bakterien, så det er vanligvis nødvendig å gå til

3. Bruk av serologiske og biokjemiske metoder.

I dette ligger det bruk av en rekke ulike tester for å få nok informasjon til å kunne sette navn på bakterien.

3.1. Serologiske metoder

Når en bakterie trenger inn i kroppen, vil den bli oppfattet som et fremmedelement og starte en rekke reaksjoner som har til hensikt å ødelegge inntrengeren. En av disse reaksjonene er produksjon av spesifikt antistoff rettet mot bakterien eller deler av denne. (Dette blir mer detaljert omtalt i Kap 10 - immunologi).

Antistoffene er definerte kjemiske forbindelser som lar seg framstille industrielt, og på den måten kan reaksjonen mellom antigen (bakterien) og antistoff flyttes ut av kroppen og finne sted på laboratoriet.

På en glassplate eller reagensrøyr blir en koloni av den ukjente bakterien løst opp i vann og tilsatt antistoff mot en bestemt bakterie. En positiv reaksjon (antigen reagerer med antistoff) vil være synlig avlesbar ved sammenklumpninger eller utfellinger av bakterieløsningen.

3.2. Biokjemiske metoder

Bakterier har ulike egenskaper og krav, bl.a. til ernæring og vekstmiljø. Derfor blir det også undersøkt om den ukjente bakterien kan vokse og livnære seg på ulike sukkerarter eller andre kjemiske forbindelser. Dette blir gjort ved å tilsette bakterien en blanding av aktuelt næringsstoff og en indikator (et stoff som skifter farge når pH-verdien går fra basisk til surt miljø eller omvendt). Dersom bakteriene kan nytte seg av dette stoffet, vil de produsere syre slik at pH- verdien forandrer seg. Indikatoren vil da skifte farge,og fargeforandringen er en positiv reaksjon.

Det finnes flere testsystemer på markedet som tester bakterien for 15–20 ulike biokjemiske reaksjoner i løpet av kort tid. (API-20, Enterotube). Positive og negative reaksjoner blir gjort om til tallkoder, og med å slå opp i tabeller, kan en få ut navnet på bakterien med 95% sannsynlighet. Disse hurtigtestene blir mest brukt overfor Gram negative bakterier.

SEROTYPER ELLER STAMMER

Ved å gjennomføre undersøkelser etter de trinn som nå er beskrevet, vil en kunne gi bakterien et navn, finne ut hvilken art den tilhører.

Dette er ofte utilstrekkelig i diagnostikken, for bakterier i samme art kan ha helt ulike egenskaper. Noen S. aureus forårsaker sykdom, mens andre er helt ufarlige. Neisseria meningitidis

(smittsom hjernehinnebetennelse) finnes i tre

ulike underarter.

Bakterier som tilhører samme art kan deles inn i forskjellige grupper basert på ulikheter mellom dem, som f.eks. ulik evne til toksinproduksjon,

resistens mot antibiotika eller små ulikheter i oppbygging av bakteriens cellevegg. Noen har kapsel, mens andre ikke har det osv.

Dette er bakgrunnen for inndeling i serotyper eller stammer, uttrykk som ofte brukes om hverandre. Vi snakker om patogene serotyper, resistente stammer osv.

GENTEKNOLOGI

Vi har tidligere i dette kapittelet gjennomgått oppbyggingen av DNA. Vi skal nå se litt nærmere på hva denne kunnskapen kan brukes til, og gjennomgå en del av forutsetningene og prinsippene i det som i dag kalles for genteknologi.

Genteknologiske metoder er i dag i bruk i flere områder innen industri og medisin. Også innenfor mikrobiologisk diagnostikk kan dette brukes. Det er imidlertid så nytt at det bare er de store sentrallaboratoriene som anvender disse metodene, men utviklingen går så raskt at vi må forvente at diagnostikk basert på genteknologi vil bli tilgjengelig i stadig større omfang.

Genteknologien bygger på en del enkle

forutsetninger.

• den kjemiske oppbyggingen av basene i DNA-

tråden (ATCG) er lik uansett hvilken art de isoleres

fra. Basene i DNA-tråden i en bakterie er altså

kjemisk lik basene fra DNA- tråden hos mennesket.

• kunnskapen om den genetiske koden forteller oss

at 3 og 3 basepar koder for en aminosyre. Et pro-

tein består som tidligere nevnt av flere aminosyrer

i bestemt rekkefølge, og dersom denne rekkeføl-

gen er kjent, kan en altså konstruere det genet som

koder for det aktuelle proteinet.

VERKTØY I GENTEKNOLOGIEN

For å kunne arbeide med et DNA molekyl trengs det spesielle verktøy. Disse er tilgjengelige i form av to ulike grupper enzymer

Restriksjonsenzymer deler DNA-tråden opp i de delene vi trenger, og DNA-ligaser limer bitene sammen slik at vi får det genet vi ønsker. I tillegg finnes det selvsagt en rekke avansert apparatur for å få til dette.

PLASMIDPROFIL

Plasmidene er som tidligere nevnt arvemateriale utenom DNA tråden. Dette er forholdsvis små molekyler der basene ligger i en ring. De genetiske egenskapene som er knyttet til plasmidene, er evne til resistens mot antibiotika/kjemoterapeutika og evne til å gi sykdom gjennom gen for toksinproduksjon. Størrelsen på disse ringene varierer fra bakterie til bakterie.

Det er utarbeidet metoder for å trekke plasmidene ut av bakteriene. Plasmidene blir så overført til en glassplate og klippet opp av enzymer .Ved gelelektroforese blir de utsatt for en elektrisk spenning som gjør at de vandrer langs denne platen slik at de minste

bitene vandrer lengst. Via en del analyser blir dette overført til en røntgenfilm, og vi får et strekmønster som er karakteristisk for den bakterien som blir testet.

Hva kan så dette brukes til?

Det er allerede brukt til å oppklare en del tilfeller av matforgiftning. Ved Salmonella typhimurium epidemien fra sjokolade for en tid siden ble det påvist at bakterier fra pasienter som var smittet fra sjokolade, hadde helt identisk strekmønster (plasmidprofil) som bakterier isolert fra sjokolade og fugler i fabrikkområdet. Smittekilden var derved påvist. (Hvordan Salmonellabakteriene overlevde i produksjonsprosessen, er et annet interessant spørsmål som vi kommer tilbake til).

Ved sykehusinfeksjoner (f.eks. Stafylokokkinfeksjoner ved en fødeavdeling) kan en ved å anvende denne metoden avgjøre om det er en smittekilde til infeksjonene, (dersom bakterier fra pasientene har samme profil). Er plasmidprofilen forskjellig, avslører dette dårlig hygiene ved avdelingen.

DNA-SEGMENTERING

Denne metoden er prinsipielt lik den forrige, bortsett fra at nå er det selve DNA tråden som testes.

Et kromosom deles opp ved hjelp av et restriksjonsenzym .Bitene behandles på samme måte som

Plasmidene, slik at det endelige resultatet på en røntgenfilm blir et strekmønster som er helt karakteristisk for dette kromosomet.

Denne metoden anvendes i rettsmedisinen og er et viktig hjelpemiddel i oppklaring av f.eks. voldtektssaker. Fra blod eller sæd blir det isolert DNA som testes på denne måten. Ved å sammenlikne strekmønsteret med prøver tatt fra mistenkte gjerningsmenn kan man avgjøre om kromosomet er identisk eller ikke. Helt identiske strekmønstre blir ansett som fellende bevis i slike saker.

Hos menneske vil strekmønsteret være atskillig mer detaljert enn det som er vist på bildet her. De leses av ved hjelp av datamaskiner som lager kurver som blir sammenliknet. Et eksempel på et slikt bilde kan du se på

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

Vi kan ofte lese om kriminalsaker som oppklares på bakgrunn av DNA materiale fra f. eks et hårstrå. For at det skal være mulig å gjennomføre en DNA segmentering på bakgrunn av et slikt funn, må det først lages mange kopier av den aktuelle DNA- tråden. Dette skjer ved en metode som kalles PCR og som i prinsippet er uhyre enkel å utføre.

Metoden brukes også ved diagnostikk av arvelige sykdommer eller identifikasjon av bakterier Forutsetningen for dette er at innenfor enkelter arter, og også innenfor individer av samme art, vil DNA- tråden ha en del som er spesiell for den enkelte art eller individ.

Den aktuelle DNA- tråden utsettes for varme slik at trådene i dobbeltspiralen vikler seg ut av hverandre, og bindingene mellom dem løses opp. Så tilsettes det store mengder baser (ATCG) og DNA- biter som er motsatte eller komplementære til segmenter før og etter det genet som skal undersøkes .Slike motsatte DNA- biter kalles for prober. Vi har i dag så stor innsikt i oppbygging av menneskets DNA at det er enkelt å finne ut hvordan de motsatte bitene skal se ut og vi kan derfor lage dem på laboratoriet.

Probene fester seg på hver ende av det genet som skal undersøkes eller testes, og et enzym som heter plymerase, gjør kjedene komplette ved å sette til baser i riktig rekkefølge.. Denne prosessen tar 2-3 minutter og kan gjentas så mange ganger vi ønsker det. Etter en times tid har laboratoriet nok materiale å arbeide med.

Teknikken har uendelig mange anvendelsesområder, og den kan også nyttes på gammelt historisk materiale . I tillegg til å være en hjelp i diagnostikk av bakterier, kan en

for eksempel påvise feil i gen som styrer celledelingen lenge før kreften viser seg hos pasienter. Av vev fra en engelsk kjemiker som døde i 1844 og som var fargeblind, er det påvist at det manglet et gen nødvendig for riktig fargesyn.

Historikere ønsker også å bruke denne metoden på pergamentet dødehavsrullene er skrevet på for å prøve å identifisere hvilke segmenter som stammer fra samme individ. Dette vil gjøre det enklere å finne ut hvilke som hører sammen av de 10000 rullene som ikke er tydet.

(link til illustrasjoner av PCR finner du på www.dvstord.com)

GEN SOM BÆRER ANLEGG FOR ARVELIGE SYKDOMMER

Ved hjelp av denne metoden er flere gen som bærer anlegg for arvelige sykdommer kartlagt. Stikkordsmessig kan nevnes at på kromosom 2, 11 og 19 finnes gen som kan disponere for hjerteinfarkt, og på kromosom nr. 11 gen som disponerer for manisk depressive sinnslidelser. I tillegg er det kartlagt mist 40 ulike onkogener ( gen som kan disponere for kreftutvikling.)

Denne kunnskap reiser en rekke problemstillinger som ligger utenfor dette fagområdet, men det skal likevel nevnes:

- hva gjør det med et menneske å vite at det bærer anlegg for sykdom det ikke finnes behandling mot ?

- kan denne informasjonen misbrukes på noen måte, f.eks i arbeidsliv eller forsikringssammenheng?

- anvendt på foster gir denne metoden mulighet til å vurdere informasjon om fosteret før 12 ukers- grensen for abort.

KRYSSING AV ARTSGRENSER

DNA er identisk oppbygget i ulike arter. Dette gjør det mulig å flytte gen fra en dyreart til en annen. Det er for eksempel gjort forsøk med å erstatte veksthormon hos mus med veksthormon hos rotte. Sammenliknet med sin eneggete tvilling hadde denne musen en enorm vekst.

Denne teknikken gjør det mulig å produsere medisin til humant bruk på dyr ( f. eks produseres koagulasjonsfaktor 8 mot blødersyke som på sau.)

BAKTERIER SOM FABRIKKER

Ved hjelp av kunnskapen om genteknologi blir det i dag produsert en rekke viktige legemiddel og stoff innen medisinen. Insulin (sukkersykehormon), veksthormon og interferon er eksempler på dette. Dette har gjort tilgjengeligheten på viktige legemiddel mye bedre enn tidligere.

Det er viktig å kjenne aminosyresammensetningen til det stoffet som bakteriene skal produsere. Proteinet insulin består av ca 250 aminosyrer. Genet for insulin vil da ha 750 basepar og kan lett lages med restriksjonsenzymer og ligaser.

Men hvordan få det inn i bakteriene ?

Igjen er det plasmidene som står sentralt. Plasmidene trekkes ut, ringen klippes opp og det ønskede genet limes inn i denne ringen. Så føres plasmidene tilbake til bakterien, og denne og alt dens avkom vil nå produsere det ønskede legemiddel som lett kan trekkes ut fra de beholdere der bakteriekulturen er.